![[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP///yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7)
Recomendados
Mais conteúdo relacionado
Mais procurados
Mais procurados (20)
Semelhante a Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια
Semelhante a Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια (19)
Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια
- 1. Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια Μοριακές τεχνικές Βασιλική Κίτσιου Τμήμα Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»
- 13. 1983 Karry Mullis 1993 Nobel Χημείας
- 36. μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμένα με δύο φθοριοχρώματα φλουρεσκεϊνης
- 54. a νίχνευση του προϊόντος ( qRT) 1 . Μη ειδικές : οι οποίες περιλαμβάνουν DNA δεσμευτικές βαφές και μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: α. Intercalators ( Et/Br) β. Minor-groove binders (SYBR Green I) 2. Ειδικέ ς : οι οποίες περιλαμβάνουν ειδικούς ανιχνευτές ( probes) 1.TaqMan® Probes 2. Molecular Beacons 3. FRET Hybridization Probes 4. Eclipse Probes 5. Amplifluor Assays 6. Scorpions Primers 7. LUX Primers 8. QZyme Primers
Notas do Editor
- Το δεοξυριβονουκλεικό οξύ ( DNA ) αποτελεί ένα τεράστιο σε μέγεθος μόριο το οποίο βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων και περιέχει τις απαραίτητες γενετικές πληροφορίες για την ανάπτυξη και τη λειτουργία όλων των γνωστών οργανισμών. Παρά το ότι ανακαλύφθηκε νωρίς υπήρχε έντονη δυσκολία στην απομόνωση, στο χειρισμό και στην ανάλυση αυτής της ιδιαίτερα ευαίσθητης σε μηχανικές δράσεις κυτταρικής ένωσης. Τα τελευταία χρόνια όμως, η ανάπτυξη μεθόδων έκλυσης DNA από τα κύτταρα καθώς και η ανάπτυξη τεχνικών πολλαπλασιασμού του DNA έφεραν επανάσταση στα εργαστήρια σε όλο τον κόσμο και έκαναν δυνατή τη χρήση των μοριακών τεχνικών στην καθημέρα πράξη τόσο σε ερευνητικό όσο και σε κλινικό επίπεδο, όχι μόνο στον τομέα της ανοσολογίας αλλά και στους άλλους εργαστηριακούς τομείς.
- Οι μέθοδοι απομόνωσης του DNA ποικίλλουν ανάλογα με το μέγεθος του μορίου που θέλουμε να προκύψει. Αν θέλουμε να χρησιμοποιήσουμε το DNA για ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου πεδίου ( Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE ) απαιτούνται φυσικά μόρια. Στην περίπτωση αυτή ο ι τεχνικές extraction αποσκοπούν στην απομόνωση ενιαίου μορίου DNA και περιλαμβάνουν τη χρήση απορρυπαντικών για τη διάσπαση των κυτταρικών και πυρηνικών μεμβρανών τους, έτσι ώστε να περιορίζονται οι μηχανικές κινήσεις στο ελάχιστο και να αποφεύγεται ο κίνδυνος σπασίματος του ευαίσθητου DNA μορίου. Αντίθετα, κατά την απομόνωση DNA που προορίζεται για τη χρήση σε PCR, οπότε δεν είναι αναγκαία η ανάκτηση του DNA ως ενιαίου μορίου, δίνεται έμφαση στην ταχύτητα της μεθόδου και στην καθαρότητα του προιόντος της απομόνωσης.
- DNA μπορούμε να απομονώσουμε από ολικό αίμα, στοιβάδα κυττάρων περιφερικού αίματος, ιστούς, εγκληματολογικό υλικό όπως κηλίδα αίματος, επιχρίσματα βλεννογόνου, τρίχες, νύχια κλπ
- Γενικά η απομόνωση DNA από τα κύτταρα μπορεί να διακριθεί σε τέσσερα στάδια: Αρχικά γίνεται διαχωρισμός των εμπύρηνων κυττάρων τα οποία στη συνέχεια λύονται αφαιρούνται οι πρωτεϊνες και οι μολυσματικοί παραγόντες και τέλος γίνεται η ανάκτηση του DNA
- Η απομόνωση περιλαμβάνει τη διάσπαση των πρωτεϊνών με πρωτεολυτικά ένζυμα (πρωτεϊνάση Κ), εκχύλισή τους με οργανικούς διαλύτες (φαινόλη και χλωροφόρμιο) ή με διαλύματα υψηλής ιοντικής ισχύος (διάλυμα NaCl μεγάλης συγκέντρωσης) και τέλος την κατακρήμνιση του DNA σε διαλύματα αλκοόλης (70%) παρουσία άλατος. Πρέπει να τονιστεί ότι όσο πιο καθαρό είναι το απομονωμένο DNA , τόσο πιο σταθερό παραμένει σε μακρόχρονη φύλαξή (για χρόνια στους 4ο C ).
- Σήμερα στο εμπόριο κυκλοφορούν kits απομόνωσης του DNA , τα οποία στηρίζονται σε διάφορες τεχνικές. Η επιλογή της μεθόδου γίνεται με βάση: την ποσότητα του DNA που χρειαζόμαστε το μοριακό βάρος ,το μέγεθος και την καθαρότητα του DNA που απαιτείται τον διαθέσιμο χρόνο την ευκολία της τεχνικής ή της μεθόδου απομόνωσης του DNA και τέλος το κόστος απομόνωσης
- Υπάρχουν τέσσερις βασικές μέθοδοι απομόνωσης γονιδιωματικού DNA : Η κλασική μέθοδος περιλαμβάνει την απομόνωση με φαινόλη και χλωροφόρμιο. Εδώ η απομόνωση του DNA γίνεται με διαδοχικές εκχυλίσεις του δείγματος με τους οργανικούς αυτούς διαλύτες. Με τη μέθοδο αυτή προκύπτει DNA μεγάλου μοριακού μεγέθους (100-150 Kb ) κατάλληλο για υβριδισμό κατά Southern αλλά και για PCR , το DNA δε που απομονώνεται είναι σταθερό στους 4ο C για μεγάλο χρονικό διάστημα.
- Η δεύτερη τεχνική βασίζεται στην ισοθειοκυανική γουανιδίνη Αρχικά γίνεται κατεργασία των δειγμάτων με ισοθειοκυανική γουανιδίνη για απομάκρυνση του DNA το οποίο στη συνέχεια προσδένεται σε προσροφητικό υλικό Celite . Το σύμπλοκο DNA - Celite διαχωρίζεται από τις πρωτεΐνες του δείγματος με επανειλημμένες πλύσεις, και τέλος τ o DNA εκλούεται από τον Celite μετά από επώαση με ρυθμιστικό διάλυμα Tris , στους 56ο C . Κύρια πλεονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η αξιοπιστία και η επαναληψιμότητα.
- Η επόμενη μέθοδος περιλαμβάνει την απομόνωση με χρήση κεκορεσμένου διαλύματος NaCl (Salting-out technique) Η τεχνική στηρίζεται στο γεγονός ότι το DNA είναι αδιάλυτο στην αιθανόλη και διαλυτό σε διαλύματα αλάτων υψηλής ιοντικής ισχύος. Η απομόνωση γίνεται από λευκά αιμοσφαίρια του περιφερικού αίματος και η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά γίνεται οσμωτική λύση των ερυθροκυττάρων και συλλογή των εμπύρηνων λευκών. Ακολουθεί επώαση με διάλυμα SDS 10% και πρωτεϊνάσης Κ στους 56ο C . Η απομάκρυνση των πρωτεϊνών και της πρωτεϊνάσης Κ γίνεται παρουσία κεκορεσμένου διαλύματος NaCl ενώ κατακρήμνιση του DNA που βρίσκεται διαλυμένο στο υψηλής συγκέντρωσης σε άλας διάλυμα γίνεται με την προσθήκη αλκοόλης.
- Τέλος απομόνωση των νουκλεϊνικών οξέων μπορεί να επιτευχθεί με τη βοήθεια μαγνητικών σφαιριδίων (Magne Sil Paramagnetic Particles - PMPs) , μια αυτοματοποιημένη τεχνική στο πρώτο βήμα της οποίας γίνεται η λύση των κυττάρων ώστε να ελευθερωθεί το DNA, το οποίο στη συνέχεια προσδένεται στα PMPs. To σύμπλοκο DNA-PMPs, περνά από διαδοχικές πλύσεις ώστε στο τέλος να γίνει η έκλουση του gDNA στην ειδικά θερμαινόμενη θέση. Πρόκειται για ένα πλήρως Αυτοματοποιημένο Σύστημα που μπορεί να απομονώσει DNA , RNA ή πρωτεΐνες από ποικιλία υλικών Τα πλεονεκτήματα της αυτοματοποιημένης μεθόδου είναι πολλά μιας και Δεν απαιτείται προεργασία των δειγμάτων . Το σύστημα μπορεί να επεξεργαστεί ταυτόχρονα λίγα ή πολλά δείγματα Και αποδίδει επαρκή ποσότητα (έως 50 μ g ) και υψηλής καθαρότητας DNA (Α260/Α280>1,8) .
- Οι κυριώτερες τεχνικές μοριακές βιολογίας που εφαρμόζονται σε ένα κλινικό ανοσολογικό εργαστήριο βασίζονται στην ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ( Polymerase Chain Reaction ή όπως είναι πιο γνωστή PCR ) Η PCR είναι πιθανόν η πιο σημαντική τεχνική που χρησιμοποιεί σήμερα η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Πήρε την ονομασία της από ένα συστατικό της μεθόδου, το ένζυμο DNA πολυμεράση, που χρησιμοποιείται για τον πολ/σμο ενός τμήματος DNA με in vitro ενζυματική αντιγραφή. Σπάνια μια εφεύρεση έχει αλλάξει την επιστήμη της βιολογίας τόσο ριζικά και σε τόσο μικρή χρονική περίοδο όσο η PCR . Με αυτή την τεχνική πολύ μικρά ποσά DNA μπορούν να αντιγραφούν πολύ γρήγορα και έτσι να πολλαπλασιαστούν σε τέτοια έκταση ώστε να μπορούν εύκολα να ανιχνευτούν, να μελετηθούν και να χρησιμοποιηθούν σε κάθε επιθυμητή εφαρμογή.
- Η PCR ανακαλύφθηκε από τον Αμερικανό χημικό Karry Mullis , το 1983. Το διάστημα εκείνο ο Mullis εργαζόταν μια από τις πρώτες εταιρείες βιοτεχνολογίας στ o Emeryville της Καλιφόρνια . Είχε επιφορτιστεί με την παραγωγή μικρών ελίκων DNA για άλλους επιστήμονες. Ο ίδιος έγραψε ότι συνέλαβε την ιδέα της PCR οδηγώντας μια νύχτα το αυτοκίνητό του κατά μήκος ενός αμερικανικού αυτοκινητοδρόμου. Δούλευε στο μυαλό του ένα νέο τρόπο ανάλυσης των DNA μεταλλάξεων όταν συνειδητοποίησε ότι αντ’ αυτού είχε ανακαλύψει μια μέθοδο πολλαπλασιασμού οποιασδήποτε νουκλεοτιδικής αλληλουχίας επιθυμούσε. Μέσα σε λίγα χρόνια η PCR έφερε επανάσταση σε παγκόσμιο επίπεδο στα βιολογικά εργαστήρια και εξασφάλισε την ύψιστη επιστημονική διάκριση για τον εφευρέτη της σε χρόνο ρεκόρ. Το 1993 μόλις 10 έτη μετά το ιστορικό ταξίδι με το αυτοκίνητο ο Karry Mullis έλαβε το Νόμπελ Χημείας. Ο λόγος για αυτή την εξαιρετική επιτυχία είναι ότι η τεχνική παρήχε λύση σε ένα από τα πιο πιεστικά προβλήματα που αντιμετώπιζε η βιολογία τότε, την αντιγραφή του DNA . ( Ήδη από τα μέσα της δεκαετίας του 1980 η τεχνική χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για τη διάγνωση νοσημάτων, όταν οι ερευνητές κατάφεραν να ταυτοποιήσουν το γονίδιο της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Περίπου την ίδια χρονική περίοδο η μέθοδος εισήχθει για χρήση στην ιατροδικαστική ιατρική)
- Κατά τη διαδικασία της PCR μικροποσότητες DNA μπορούν γρήγορα και επαναλαμβανόμενα να αντιγραφούν αποδίδοντας μια ποσότητα DNA ικανή να ελεγχθεί με τις συμβατικές εργαστηριακές μεθόδους. Ο πολλαπλασιασμός επιτελείται σε διαδοχικούς κύκλους DNA σύνθεσης που ονομάζονται θερμικοί κύκλοι. Από ένα επιλεγμένο DNA τμήμα παράγονται δύο αντίγραφα, στη συνέχεια τέσσερα, οκτώ και ούτω καθ’ εξής. Ο πολλαπλασιασμός είναι εκθετικός. Η αλληλουχία του νουκλεινικού οξέος-στόχου μπορεί να είναι ένα απλό γονίδιο, ένα τμήμα γονιδίου ή μια μη κωδικοποιούσα αλληλουχία. Θεωρητικά ένα μόλις DNA μόριο είναι επαρκές. Η PCR είναι για αυτό το λόγο μια από τις πλέον ευαίσθητες βιολογικές τεχνικές που έχουν ποτέ επινοηθεί.
- Όσον αφορά το στόχο του πολλαπλασιασμού ( DNA template ) η νουκλεινική αλληλουχία που μπορούμε να πολλαπλασιάσουμε μπορεί να είναι είτε DNA είτε RNA αλλά σε τελική ανάλυση πάντα πολ/ζουμε DNA γιατί μετατρέπουμε το R ΝΑ σε DNA. Με τις συνήθεις τεχνικές πολ/ζονται κομμάτια νουκλεινικού οξέος μεγέθους 50-1500 βάσεων αν και ορισμένες τεχνικές επιτρέπουν τον πολλαπλασιασμό μεγαλύτερων τμημάτων
- Προκειμένου ένα τεμάχιο DNA να πολλαπλασιαστεί με τη βοήθεια της PCR , κατάλληλοι εκκινητές πρέπει να σχεδιαστούν και να συντεθούν. Οι εκκινητές είναι μικρού μήκους ολιγονουκλεοτίδια δηλ. χημικά σχεδιασμένα, βραχέα θραύσματα DNA μονής έλικας τα οποία περιέχουν νουκλεοτίδια συμπληρωματικά των δύο άκρων του τμήματος του DNA -στόχου που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. H επιλογή των κατάλληλων εκκινητών είναι μια εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία, καθώς η ισχυρή σύνδεσή τους στα ειδικά σημεία του μητρικού DNA που εμείς επιθυμούμε και στη θερμοκρασία που κρίνεται απαραίτητη ώστε να εξασφαλίζεται η μέγιστη δράση των υπολοίπων αντιδραστηρίων, επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως το μέγεθός τους, το περιεχόμενό των βάσεών τους , ενώ κριτικής σημασίας για την επιτυχία της PCR είναι ο σχεδιασμός του 3’ άκρου του εκκινητή. Το ιδεώδες μέγεθος ενός εκκινητή (με περιεκτικότητα βάσεων G + C περίπου 40-60%) είναι γενικά από 15-40 νουκλεοτίδια με μια θερμοκρασία σύνδεσης μεταξύ 50ο C και 74ο C . Σήμερα υπάρχουν ειδικά υπολογιστικά προγράμματα που βοηθούν στο σχεδιασμό των εκκινητών αλλά η τελική επιλογή γίνεται μόνο μετά από επαναλαμβανόμενες δοκιμές.
- Για τη σύνθεση DNA απαιτούνται ελεύθερα δεοξυνουκλεοτίδια ( dNTPs ). Αυτά είναι 4 όσες και οι βάσεις: αδενίνη, θυμίνη, γουανίνη και κυτοσίνη. Τα τέσσερα dNTPs ( dATP , dTTP , dGTP & dCTP ) πρέπει να βρίσκονται στο μίγμα της αντίδρασης σε ισοδύναμες συγκεντρώσεις (20 - 200μ M) για την ελαχιστοποίηση λαθών κατά την ενσωμάτωση και για την επίτευξη της βέλτιστης ειδικότητας και πιστότητας. .
- Για την ενσωμάτωση των δεοξυνουκλεοτιδίων απαραίτητη είναι η δράση ενός ενζύμου, της πολυμεράσης. Συνήθως χρησιμοποιείται η Taq πολυμεράση, ένα θερμοάντοχο στους 70ο C ένζυμο, το οποίο αρχικά απομονώθηκε από ένα θερμόφιλο βακτήριο των θερμών πηγών, το Thermus aquarius . Τα ένζυμα αυτά καταλύουν τη σύνθεση δίκλωνου DNA από μονόκλωνο. Δεν μπορούν να ξεκινήσουν τη σύνθεση της νέας αλυσίδας de novo , αλλά μπορούν να προσθέσουν δεοξυριβονουκλεοτίδια ( dNTPs) στο 3’ άκρο του συνδεδεμένου στο DNA στόχο primer οδηγώντας στην παραγωγή ενός DNA αντιγράφου.
- Για να επιτευχθεί η μέγιστη δραστικότητα και σταθερότητα της DNA πολυμεράσης απαραίτητο είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα. Το κατάλληλο περιβάλλον πρέπει να έχει pH που να κυμαίνεται από 8,3 έως 8,9 Αυτό εξασφαλίζεται με τη χρήση διαλύματος 10 έως 50 mM Tris . HCl ενώ η προσθήκη μέχρι και 50 mM KCl στο μείγμα της αντίδρασης διευκολύνει την σύνδεση των εκκινητών
- Τέλος, για την PCR απαιτείται και η χρήση δισθενών ιόντων μαγνησίου σε συγκέντρωση 0,5 έως 2,5 mM . Η παρουσία τους επιδρά στην σύνδεση των εκκινητών, στις θερμοκρασίες αποδιάταξης του DNA και στη δράση των ενζύμων.
- Ένα τυπικό PCR πρωτόκολλο περιλαμβάνει 25-40 θερμικούς κύκλους και κάθε κύκλος αποτελείται από 3 στάδια: Στάδιο αποδιάταξης ( Denaturation step ): το DNA -στόχος επωάζεται στους 94-98ο C για 20-30 δευτερόλεπτα. Η θερμοκρασία αυτή προκαλεί την τήξη και το διαχωρισμό των ελίκων του DNA -στόχου καταστρέφοντας τους υδρογονικούς δεσμούς μεταξύ των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων και προκαλώντας την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA σε μονόκλωνο Στάδιο σύνδεσης εκκινητών ( Annealing step ): Η θερμοκρασία μειώνεται στους 50-65ο C για 20-40 δευτερόλεπτα επιτρέποντας την σύνδεση των εκκινητών στις συμπληρωματικές μονόκλωνες αλληλουχίες-στόχους. Στη συνέχεια η πολυμεράση συνδέεται στο 3΄ άκρο του εκκινητή και ξεκινά η σύνθεση του DNA . Στάδιο επιμήκυνσης ( Elongation step ): Η θερμοκρασία ανεβαίνει στους 72ο C και η DNA πολυμεράση προσθέτοντας συμπληρωματικά dNTPs ως επέκταση των εκκινητών από το 3΄ προς το 5΄ άκρο, συνθέτει μια νέα DNA άλυσο, ακριβές αντίγραφο του αρχικού DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε.
- Υπάρχουν διάφορες μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιούνται στα ανοσολογικά εργαστήρια. Μια από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες είναι η PCR-SSOP Αρχή της μεθόδου Η τεχνική αυτή βασίζεται στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων τμημάτων των γονιδίων που θέλουμε να μελετήσουμε με PCR και εν συνεχεία στον υβριδισμό του προϊόντος της PCR με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές (oligonucleotide Probes) συγκεκριμένης αλληλουχίας. Οι ανιχνευτές αυτοί είναι μικρά τμήματα DNA (μήκους 19-24 βάσεων συνήθως), τα οποία έχουν αλληλουχία συμπληρωματική με αυτή των γονιδίων που θέλουμε να μελετήσουμε, παρασκευάζονται δε συνθετικά με χημικούς τρόπους. Διαδικασία της μεθόδου Απομόνωση του χρωμοσωμιακού DNA Πολλαπλασιασμός με PCR της μεταβλητής περιοχής των υπό εξέταση γονιδίων (π.χ. εξόνιο 2 των HLA τάξης ΙΙ γονιδίων, εξόνια 2 και 3 των HLA τάξης Ι γονιδίων) με το κατάλληλο ζεύγος εκκινητών. Αποδιάταξη του προϊόντος της PCR (δηλαδή το DNA μετατρέπεται από δίκλωνο σε μονόκλωνο) και στη συνέχεια μεταφέρεται σε ειδικές μεμβράνες όπου και ακινητοποιείται. Υβριδισμός του μονόκλωνου DNA με τους κατάλληλους ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, ύστερα από επώαση στις ανάλογες θερμοκρασίες. Προκειμένου να γίνει ορατός ο υβριδισμός, είτε το προϊόν της PCR, είτε συνηθέστερα οι ανιχνευτές σημαίνονται είτε με ραδιενεργές ουσίες π.χ. 32P είτε με ένζυμα π.χ. το σύστημα βιοτίνης–στρεπταβιδίνης–αλκαλικής φωσφατάσης. Ανίχνευση του υβριδικού (δίκλωνου) μορίου DNA , η οποία μπορεί να επιτευχθεί με: α) με αυτοραδιογραφία εφόσον χρησιμοποιούνται ραδιενεργοί ιχνηθέτες β) με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας και αποτύπωση του οπτικού σήματος σε ακτινογραφικό φίλμ και γ) με χρωμογόνα υποστρώματα, στα οποία επιδρούν ένζυμα π.χ. αλκαλική φωσφατάση και προκαλείται αλλαγή ή εμφάνιση χρώματος, η οποία μπορεί εύκολα να γίνει αντιληπτή με απλή επισκόπηση ή με φωτομέτρηση (παραλλαγή της τεχνικής ELISA). To οπτικό σήμα που λαμβάνεται μπορεί να έχει μορφή κηλίδας ( dot-blot ) ή γραμμής ( Line Probe Assay ). Αξιολόγηση του αποτελέσματος γίνεται με βάση τους ανιχνευτές που έδωσαν θετική αντίδραση, δηλαδή βρήκαν στο υπό εξέταση δείγμα την συμπληρωματική τους αλληλουχία και υβριδίσθηκαν και με τη βοήθεια ειδικών πινάκων ανάγνωσης ή με ειδικά προγράμματα H/Y (software).
- Υπάρχουν 2 τεχνικές υβριδισμού. Ο κλασικός υβριδισμός ( forward SSOP) και τον οποίο το προϊόν της PCR ακινητοποιείται σε μεμβράνη και ο κάθε ανιχνευτής που έχει προηγουμένως σημανθεί ισοτοπικά ( 32 P ) ή ενζυμικά (διγοξιγενίνη, αλκαλική φωσφατάση) προστίθεται χωριστά. Και ο ανάστροφος υβριδισμός ( reverse SSOP ) κατά τον οποίο ακινητοποιημένοι αυτή τη φορά πάνω σε ειδικές ταινίες βρίσκονται οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές και προστίθεται σε αυτούς το προϊόν της PCR . Ακολουθεί υβριδισμός και ανίχνευση του υβριδικού προϊόντος, συνήθως με χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων.
- Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική είναι η reverse SSOP μια διαδικασία ανάστροφου υβριδισμού κατά την οποία η αλληλουχία στόχος ενισχύεται με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές σημασμένους με βιοτίνη.
- Στη συνέχεια το προιόν της PCR αποδιατάσσεται με χημικό τρόπο και γίνεται υβριδοποίηση ( blotting) των μονόκλωνων τμημάτων με ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ( probes) , οι οποίοι βρίσκονται ακινητοποιημένοι πάνω σε ταινίες νιτροκυτταρίνης (strips), υπό μορφή παραλλήλων γραμμών. Ακολουθεί προσθήκη στρεπταβιδίνης σημασμένη ς με αλκαλική φωσφατάση , η οποία συνδέεται με τα βιοτινυλιωμένα δίκλωνα υβριδικά μόρια. Τέλος γίνεται ε πώαση με χρωμογόνο , το οποίο με την επίδραση της αλκαλικής φωσφατάσης δίνει χαρακτηριστικό χρώμα μωβ/καφέ.
- Η αξιολόγηση γίνεται με βάση το υπόδειγμα ( pattern ) των ανιχνευτών που έδωσαν θετική αντίδραση. Επιτυγχάνεται δε, είτε με τη βοήθεια ειδικών πινάκων αξιολόγησης , είτε με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος στον ηλεκτρονικό υπολογιστή ( software - Expert genotyping program ).
- Η μέθοδος βρίσκει εφαρμογή στην τυποποίηση των HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων, γονοτυπική ανάλυση ιών π.χ. HCV, HIV, SNPs γονοτύπωση πχ. Α poE
- Μια παραλλαγή της SSOP είναι αυτή που χρησιμοποιεί την τεχνολογία BEADS ARRAY ενώ η μέτρηση γίνεται με τη βοήθεια αναλυτή ροής LUMINEX. Η μέθοδος αποτελεί μία διαδικασία ανάστροφου υβριδισμού ( reverse hybridization ). Η τεχνολογία αυτή χρησιμοποιεί ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ( probes ), προσδεμένους σε μικροσφαιρίδια ( beads ), για την αναγνώριση αλληλομόρφων στο υπό εξέταση δείγμα DNA . Στη συνέχεια γίνεται ενίσχυση του DNA -στόχου με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ( PCR ).
- Οι ανιχνευτές είναι συζευγμένοι σε 100 μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου βαμμένα με δύο φθοριοχρώματα φλουροσκείνης (χρώματος κόκκινο-μωβ) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις οι οποίες μπορούν να αναγνωριστούν από τον αναλυτή ροής ( Luminex) .
- Η διαδικασία της μεθόδου έχει ως εξής: Αρχικά το DNA-στόχος ενισχύεται με PCR, χρησιμοποιώντας ειδικούς βιοτινυλιωμένους εκκινητές (primer). To βιοτινυλιωμένο προϊόν της PCR αποδιατάσσεται χημικά και υβριδοποιείται με τους ανιχνευτές (probes), οι οποίοι είναι συζευγμένοι σε μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου . Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με τη χρήση στρεπταβιδίνης συζευμένης με R-Φυκοερυθρίνη (SAPE).
- Καθώς το υδραυλικό σύστημα του αναλυτή ροής αναγκάζει τα σφαιρίδια να ρέουν το ένα μετά το άλλο μπροστά από 2 ακτίνες laser το μηχάνημα αναγνωρίζει και διακρίνει την ένταση του φθορισμού της PE (φυκοερυθρίνης) σε κάθε μικροσφαιρίδιο. Η ανάγνωση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων γίνεται μέσω ειδικού προγράμματος Η/Υ ( software ) που διατίθεται μαζί με το kit των αντιδραστηρίων.
- Η συγκεκριμένη τεχνολογία έχει βρει ευρεία εφαρμογή στον τομέα της ανοσολογίας πχ στην τυποποίηση HLA αλληλίων , στην μέτρηση ιικού φορτίου, στην ανίχνευση ογκογονιδίων κλπ
- Μια άλλη ευρέως διαδεδομένη στα ανοσολογικά εργαστήρια μέθοδος είναι η PCR-SSP ( Polymerase chain reaction - SPECIFIC SEQUENCE PRIMERS) Η τεχνική αυτή βασίζεται στην αρχή σύμφωνα με την οποία, ένας εκκινητής με πλήρως συμπληρωματική αλληλουχία με το ένα από τα δύο τα άκρα της ειδικής περιοχής που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε χρησιμοποιείται πιο αποτελεσματικά σε μια PCR αντίδραση από άλλους εκκινητές που έχουν μία ή περισσότερες διαφορές (mismatches) στο 3΄άκρο τους. Σε αυτή την τεχνική γίνονται ταυτόχρονα πολλές PCR σε κάθε μία από τις οποίες χρησιμοποιείται ζεύγος εκκινητών που ταιριάζουν απόλυτα με τα άκρα των αλληλομόρφων γονιδίων τα οποία θέλουμε να προσδιορίσουμε
- Τα πολλαπλασιασμένα τμήματα του DNA, που προκύπτουν μετά τις PCR αντίδρασεις, διαχωρίζονται με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα σε πήκτωμα αγαρόζης Το προιόν της ηλεκτροφόρησης γίνεται ορατό ύστερα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία με την προσθήκη χρωστικής Ethidium Bromide και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό χαρτί.
- Για την αξιολόγηση λαμβάνονται υπόψη οι θετικές αντιδράσεις (παρουσία ειδικού προϊόντος) και με βάση ειδικούς πίνακες ανάγνωσης ή προγράμματα Η/Υ ( software ) εξάγεται το τελικό αποτέλεσμα
- H τεχνική εφαρμόζεται στην τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων καθώς και στον προσδιορισμό αλληλομόρφων διαφόρων γονιδίων.
- Παρ’όλη τη μεγάλη ευαισθησία της PCR κάποιες φορές υπάρχουν προβλήματα , ιδιαίτερα όταν τα υπό εξέταση νουκλεϊνικά οξέα βρίσκονται σε μικρή ποσότητα στο δείγμα μας ή είναι μερικώς αποικοδομημένα ή κακής ποιότητος. Άρα και το τελικό προϊόν θα είναι κάτω από τα όρια της ανίχνευσης. Η εφαρμογή της φωλιασμένης (nested) PCR μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία (έως και 1000 φορές) αλλά και την εξειδίκευση μιας κλασσικής PCR.
- Η φωλιασμένη PCR ως μέθοδος συνίσταται σε δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR, όπου το προϊόν της πρώτης PCR (το οποίο δεν είναι ανιχνεύσιμο) χρησιμοποιείται ως στόχος (μήτρα) για τη δεύτερη αντίδραση PCR. Ονομάζεται δε φωλιασμένη διότι οι εκκινητές, που χρησιμοποιούνται στη 2η PCR συνδέονται στο DNA-στόχο εσωτερικά (φωλιασμένα) σε σχέση με τους εκκινητές της πρώτης αντίδρασης. Επομένως το προϊόν της δεύτερης PCR θα έχει πάντα μικρότερο μέγεθος απ’αυτό της πρώτης PCR.
- Εφαρμογές: σε περιπτώσεις όπου το υπό εξέταση υλικό είναι πολύ λίγο ή αυτό που αναζητούμε βρίσκεται σε πολύ λίγα αντίγραφα μέσα στο γονιδίωμα πχ. έλεγχος της κλωνικότητας του BcR υποδοχέα και συγκεκριμένα της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών ( IgH )
- Με την κλασσική τεχνική της PCR μπορεί κανείς να μελετήσει το DNA, αλλά όχι το RNA. Λύση στο πρόβλημα αυτό ήλθε να δώσει η reverse transcriptase-PCR . Με την τεχνική αυτή το ολικό RNA ή mRNA των υπό εξέταση κυττάρων ή ιστών μετατρέπεται με τη βοήθεια του ενζύμου ανάστροφη τρανσκριπτάση (Reverse transcriptase) σε cDNA ( complementary DNA ) το οποίο στη συνέχεια ενισχύεται με κλασσική ή ποσοτική PCR Η μέθοδος εφαρμόζεται: στη μελέτη RNA ιών όπως ο HIV και ο HCV
- Μια άλλη μοριακή τεχνική είναι η ποσοτική ( QUANTITATIVE ) PCR αναπτύχθηκε με σκοπό να ξεπεραστεί η βασική αδυναμία της παραδοσιακής PCR , η οποία ανιχνεύει μεν την παρουσία ή απουσία του DNA -στόχου μη μπορώντας όμως να δώσει ποσοτικά αποτελέσματα. Με την ποσοτική PCR ελέγχεται αν μια συγκεκριμένη DNA αλληλουχία είναι παρούσα σε ένα δείγμα ενώ επίσης υπολογίζεται και ο αριθμός των αντιγράφων ( copies ) που υπάρχουν στο δείγμα αυτό.
- Έχουν αναπτυχθεί δυο παραλλαγές της ποσοτικής PCR Η ανταγωνιστική και η PCR πραγματικού χρόνου
- Στην ανταγωνιστική PCR η ποσοτικοποίηση του υπό εξέταση γονιδιώματος ( DNA ή RNA ), εκτελείται με τη χρήση του προτύπου ποσοτικοποίησης ( QS ), το οποίο είναι μία δεύτερη αλληλουχία, που προστίθεται σε κάθε δείγμα σε γνωστή συγκέντρωση. Στην πραγματικότητα είναι ένα μη μολυσματικό μόριο, που περιέχει τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με τον DNA ή RNA στόχο και δημιουργεί ένα προϊόν ενίσχυσης με την ίδια σύνθεση βάσεων με την αλληλουχία στόχο. Εκείνο όμως που το διακρίνει είναι ότι περιέχει και μια μοναδική θέση δέσμευσης ιχνηθέτη ( probes ) που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου ( amplicon ), του προτύπου ποσοτικοποίησης από τον κλώνο ( amplicon ) του DNA ή RNA στόχου.
- Το πρότυπο ποσοτικοποίησης, ενσωματώνεται σε κάθε μεμονωμένο δείγμα σε ένα γνωστό αριθμό αντιγράφων, και μεταφέρεται μέσω της προετοιμασίας του δείγματος, της PCR ενίσχυσης, του υβριδισμού και της ανίχνευσης μαζί με την αλληλουχία στόχο. Τα επίπεδα DNA ή RNA στα δείγματα εξέτασης υπολογίζονται συγκρίνοντας το σήμα του ενισχυμένου DNA ή RNA στόχου με το σήμα του προτύπου ποσοτικοποίησης για κάθε δείγμα. Η διαδικασία ποσοτικοποίησης στηρίζεται στο σχηματισμό ενός έγχρωμου συμπλόκου, η απορρόφηση του οποίου μετράται σε μήκος κύματος 660 nm από τον αναλυτή COBAS AMPLICOR .
- Πιο ακριβής παραλλαγή της ποσοτικής PCR είναι η REAL TIME ( QRT - PCR ) . Το κύριο χαρακτηριστικό αυτής της μεθόδου είναι ότι το πολλαπλασιαζόμενο DNA προσδιορίζεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο, γεγονός που αποτελεί μια νέα προσέγγιση σε σχέση με την κλασσική PCR , όπου το προϊόν της αντίδρασης ανιχνεύεται στο τέλος.
- Η μέθοδος επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό της αλληλουχίας που μας ενδιαφέρει είτε από έναν πληθυσμό κυττάρων (ιστός ή κυτταροκαλλιέργεια), είτε πρόσφατα ακόμη και από ένα μονό κύτταρο. Η διαδικασία στηρίζεται στην ανίχνευση του φθορισμού που παράγεται από ένα μόριο, ο οποίος φθορισμός αυξάνει, καθώς προχωρά η αντίδραση. Αυτό το μόριο, το οποίο είναι σημασμένο με μια φθορίζουσα χρωστική, μετά από διέγερση, εκπέμπει ένα φωτεινό σήμα το οποίο αυξάνει σε ένταση σε άμεση αναλογία προς το ποσό του ενισχυμένου προϊόντος PCR και ως εκ τούτου, ποσοτικοποιεί το DNA στόχο.
- Η ανίχνευση του προϊόντος μπορεί να γίνει είτε μη ειδικά με τη βοήθεια DNA δεσμευτικών βαφών ( Intercalators , Minor - groove binders ) είτε ειδικά με τη χρήση ανιχνευτών probes ( TaqMan ® Probes , Molecular Beacons , FRET Hybridization Probes , Eclipse Probes κλπ).
- Η ποσοτική PCR βρίσκει εφαρμογή στην ποσοτικοποίηση της έκφρασης γονιδίων , στην Microarray επιβεβαίωση, στη μέτρηση ιικού φορτίου, στην SNP γονοτύπωση κλπ
- Κλείνοντας οφείλουμε να αναφερθούμε και στην ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΤΗΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ή όπως είναι πιο γνωστό το DNA Sequencing Η πληρέστερη ανάλυση ενός κλωνοποιημένου κομματιού DNA επιτυγχάνεται με προσδιορισμό της πρωτοδιάταξής του. Η τεχνική sequencing μας επιτρέπει να διαβάσουμε βάση προς βάση τη νουκλεοτιδική αλληλουχία ένα τμήματος DNA . Στο τέλος της δεκαετίας του 1970 αναπτύχθηκαν δύο μέθοδοι που επιτρέπουν τον προσδιορισμό τμήματος DNA το οποίο είτε έχει παραχθεί με κλωνοποίηση είτε έχει πολλαπλασιαστεί με PCR : Η χημική κατά Maxam & Gilbert , η οποία δεν έχει βρει ιδιαίτερη ανταπόκριση και η ενζυμική ΚΑΤΑ SANGER Κλείνοντας θα ήθελα να πω δυο λόγια για την τεχνική ανάλυσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ή όπως είναι πιο γνωστό για το DNA sequencing. Είναι μια τεχνική που βοηθά στην πληρέστερη ανάλυση ενός κομματιού DNA καθώς επιτρέπει να διαβάσουμε την αλληλουχία αυτή βάση προς βάση.
- Σύμφωνα με τη χημική μέθοδο το τμήμα του DNA , του οποίου την πρωτοδιάταξη θέλουμε να προσδιορίσουμε, αποδιατάσσεται και σημαίνεται με ραδιενεργό ουσία (συνήθως με 32 P ) στο ένα άκρο του. Το σεσημασμένο DNA μοιράζεται σε τέσσερα δείγματα και το κάθε δείγμα υποβάλλεται σε χημική αντίδραση που τροποποιεί ειδικά μια από τις τέσσερις βάσεις του DNA ( A , T , C , G ). Ακολουθεί αντίδραση με πιπεριδίνη οπότε το DNA σπάει στις θέσεις που έχει τροποποιηθεί.
- Ως αποτέλεσμα σε κάθε ένα από τα τέσσερα δείγματα δημιουργείται ένας πληθυσμός σεσημασμένων DNA θραυσμάτων των οποίων το μήκος εξαρτάται από την απόσταση της τροποποιημένης βάσης από το σεσημασμένο άκρο του μορίου. Τα τέσσερα δείγματα ηλεκτροφορούνται το ένα δίπλα στο άλλο σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης, τα κομμάτια του DNA διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος τους και γίνονται ορατά με αυτοραδιογραφία. Με βάση τέλος τις ζώνες αμαύρωσης ( bands ) που προκύπτουν από την αυτοραδιογραφία γίνεται ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας.
- Η δεύτερη μέθοδος sequencing που αποτελεί πλέον μέθοδο εκλογής είναι η ενζυμική ΚΑΤΑ SANGER η οποια και έχει τελικά επικρατήσει γιατί χρησιμοποιεί λιγότερα χημικά τοξικά και μικρότερα ποσά ραδιενεργούς ουσίας. Στη μέθοδο αυτή το προς ανάλυση τμήμα του DNA χρησιμεύει ως εκμαγείο για τη σύνθεση αντιγράφων τα οποία έχουν το ίδιο σημείο έναρξης αλλά διακόπτονται σε διαφορετικά σημεία. Η αρχή της βασίζεται στην εισαγωγή τροποποιημένων δεσοξυνουκλεοτιδίων που ονομάζονται διδεσοξυνουκλεοτίδια ( ddNTP ). Αυτά φέρουν υδρογόνο αντί υδροξυλίου στη θέση 3΄ της δεσοξυριβόζης και η ενσωμάτωσή τους στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα εμποδίζει την περαιτέρω επιμήκυνσή της καθώς δεν είναι εφικτός ο σχηματισμός φωσφοδιεστερικού δεσμού.
- Πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις αντιγραφής της αλληλουχίας που χρησιμοποιείται ως εκμαγείο από την DNA πολυμεράση, με την κατάλληλη αναλογία dNTP / ddNTP Κάθε μια από τις τέσσερις αντιδράσεις περιέχει ένα διαφορετικό ddNTP αλλά όλα τα dNTP , ένα εκ των οποίων οφείλει να είναι ραδιοσημασμένο.
- Καθώς αρχίζει ο πολυμερισμός του εκκινητή οι θέσεις πχ της γουανίνης καταλαμβάνονται από το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο γουανίνης, οπότε εξακολουθεί ο πολυμερισμός, αλλά που και που γίνεται ενσωμάτωση το διδεοξυριβουνοκλεοτιδίου γουανίνης, οπότε έχουμε λήξη του πολυμερισμού. Παρόμοιες επωάσεις γίνονται παρουσία του καθενός από τα υπόλοιπα διδεοξυριβουνοκλεοτίδια με αποτέλεσμα τη λήξη του πολυμερισμού στις αντίστοιχες θέσεις. Αν ο λόγος των συγκεντρώσεων ddNTP : dNTP έχει επιλεγεί σωστά θα προκύψει ένα μίγμα από σεσημασμένες αλυσίδες, που τελειώνουν με ένα ddNTP στο 3΄άκρο, τα μήκη των οποίων εξαρτώνται από τη σχετική θέση της συγκεκριμένης βάσης από το άκρο του DNA . O διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμίδης και η λήψη αποτυπώματος σε φίλμ επιτρέπει το διάβασμα της αλληλουχίας του DNA .
- Οι συνεχώς αυξανόμενες εφαρμογές της νουκλεοτιδικής ανάλυσης οδήγησαν στην ανάγκη αυτοματοποίησης της μεθόδου. Σήμερα χρησιμοποιούνται ευρέως συστήματα αυτόματης ανάλυσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας όπου εφαρμόζεται η μέθοδος κατά Sanger αλλά στην πρώτη φάση γίνεται εκθετικός πολλαπλασιασμός του DNA -στόχου με PCR .
- Στα αυτόματα συστήματα χρησιμοποιούνται 4 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, μια για κάθε βάση, laser για τη διέγερση των φθοριοχρωμάτων, ανιχνευτές για τη συλλογή των εκπομπών. Τα τελικά προϊόντα ηλεκτροφορούνται όλα μαζί για να μειώνονται τα προβλήματα που οφείλονται στη διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα από σειρά σε σειρά του πηκτώματος. Τέλος τα συστήματα αυτά διαθέτουν ειδικά software , τα οποία δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα.
- Εφαρμογές: Οι μέθοδοι sequencing σήμερα πλέον είναι αυτοματοποιημένες και ταχείες και αποτελούν τον πιο αξιόπιστο τρόπο καθορισμού της αλληλουχίας DNA . Στα σύγχρονα ανοσολογικά εργαστήρια χρησιμοποιούνται ευρέως για την τυποποίηση των HLA αντιγόνων ( Sequence Based Typing – SBT ) που αποτελεί το gold standard της τυποποίησης, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις όπου υπάρχουν διφορούμενα ( ambiguous ) αποτελέσματα.
- Διαδικασία της μεθόδου Απομόνωση του χρωμοσωμιακού DNA Πολλαπλασιασμός του DNA επιτυγχάνεται με PCR χρησιμοποιώντας πολλά ζεύγη εκκινητών τα οποία είναι απολύτως ειδικά για το γονίδιο που θέλουμε να προσδιορίσουμε.
- Για την έναρξη του πολλαπλασιασμού χρησιμοποιείται ζεύγος εκκινητών ( primers ) δηλ. συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα 3΄ του DNA στόχου. Η παραγωγή των αντιγράφων γίνεται με τη βοήθεια των ενζύμων Taq polymerase . Τα ένζυμα αυτά καταλύουν τη σύνθεση δίκλωνου DNA από μονόκλωνο. Δεν μπορούν να ξεκινήσουν τη σύνθεση της νέας αλυσίδας de novo , αλλά μπορούν να προσθέσουν δεοξυριβονουκλεοτίδια ( dNTPs) στο 3’ άκρο του συνδεδεμένου στο DNA στόχο primer οδηγώντας στην παραγωγή ενός DNA αντιγράφου.