Class about genetic engineering of microrganisms. Important concepts in molecular biology, classical molecular methods, recombinant DNA technology, OGMs

1. NG-110 Disciplina Microbiologia Ambiental ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS

2. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS -Conceitos básicos -Clonagem Molecular -Obtenção de Microrganismos Geneticamente Modificados -Vetores de clonagem/expressão -Tranformação bacteriana -Outros Métodos -Aplicações e Indústria - Breaktrough

3. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Conceitos Básicos

4. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS CONCEITOS BASICOS “ The central Dogma of Molecular Biology” -Waton & Crick, 1958: Define como unidirecional o fluxo de informação entre as 3 grandes classes de biopolímeros (DNA, RNA e proteínas)

6. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Clonagem Molecular

7. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS CLONAGEM MOLECULAR FUNÇAO: obtenção cópias múltiplas de um fragmento de DNA definido METODOS: Envolve basicamente 4 passos - Fragmentação e amplificação (PCR), ligação, transfecção do alvo e seleção

8. CLONAGEM MOLECULAR FERRAMENTAS MOLECULARES ESSENCIAIS: ENZIMAS DE RESTRIÇAO Década de 70: descoberta acidental da primeira endonuclease ou enzima de restrição (Nobel!)

9. CLONAGEM MOLECULAR ENZIMAS DE RESTRICAO -Enzimas de Restrição: endonucluases sítios-específicas isoladas de procariotos; proteção do DNA ao ataque dos fagos,

10. ENZIMAS DE RESTRICAO ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS CLONAGEM MOLECULAR -Aplicação direta na clonagem molecular: sítio palindrômico de DNA é uma sequência a qual se obtem a mesma leitura nas fitas direta (5’ 3’) e reversa (3’ 5’). E possível obter-se extremidades coesivas ou cegas que são utilizadas no passo de ligação do DNA.

11. DNA LIGASE CLONAGEM MOLECULAR -Promove a ligação entre 2 moléculas de DNA; formação de uma ligação fosfodiéster entre as extremidades 3’-OH e 5’-PO 4

12. DNA POLIMERASE CLONAGEM MOLECULAR -Polimeriza moléculas de DNA a partir de uma extremidade 3’-OH, utilizado a fita homologa como molde (Ex. Taq polimerase) TRANSCRIPTASE REVERSA -Polimeriza uma fita de DNA a partir de uma fita-molde de mRNA; foram isoladas de retrovírus; utilização na síntese de cDNA -Extremamente importante na chamada “genética reversa”

13. APLICAÇOES DA CLONAGEM MOLECULAR -Sequenciamento de DNA - Fingerprints (estudos de diversidade) -Produção em larga escala de proteínas -Obtenção de Organismos geneticamente modificados ( OGMs ) Clonagem Molecular X Clonagem de Organismos -Clonagem também ocorre naturalmente: reprodução vegetativa/apomixia -Plantas, Fungos, Eucariotos, Dolly!!! CLONAGEM MOLECULAR

14. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Obtenção de um Organismo Geneticamente Modificado (OGM)

15. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Obtenção de um OGM: Passo à passo - Amplificação Fragmento de Interesse (PCR) -Escolha de um vetor de Transformação -Escolha do método de seleção dos OGM’s -Escolha do método de Transformação

16. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ISOLAMENTO DO GENE DE INTERESSE -2 Estratégias usuais: -Biblioteca de DNA e PCR -mRNA como template -Em caso de sequências conhecidas: análise de banco de dados em busca da sequência de interesse e síntese de primers para PCR -Amplificação do DNA de interesse por PCR OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

17. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Obtenção de um OGM: Passo à passo - Amplificação Fragmento de Interesse (PCR) -Escolha de um vetor de Transformação -Escolha do método de Transformação -Escolha do método de seleção dos OGM’s

18. OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -Uma vez determinado o gene que será clonado e o organismo alvo de modificação: é necessário definir a melhor estratégia para a inserção do novo gene no microrganismo Estratégias conhecidas: -Vetores (plasmídeos utilizados em engenharia genética) Plamídeos – DNA circular extracromossomal (0.1 – 10 Kb) BACs – plasmídeos mini-F (75 – 300 Kb) Cosmídeos – DNA circular extracromossomal (35 – 50 Kb) Fosmídeos – similares aos cosmídeos, porém baseados no plasmídeo F -Transdução Viral: vírus derivado do Fago Lambda; moléculas lineares de DNA que podem carregar sequências estrangeiras de DNA (8 – 20 Kb) -Lipossomas -Transposons

19. -Sequência responsável pela auto-replicação (Ori) -Marcador para seleção -Sítio de clonagem múltipla ( polylinker ) -promotores fortes e genes repórter em caso de vetores de expressão VETORES OU PLASMIDEOS Características essenciais: OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

20. ORIGEM DE REPLICAÇAO -Origem de replicação (geralmente os plasmídeos naturais que são utilizados como backbones de construções são autoreplicativos) *pode-se considerar essa característica como a base da clonagem molecular! OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -Plamídeos integrativos ou epissomais

21. -Sequência responsável pela auto-replicação (Ori) -Genes Marcadores para seleção -Sítio de clonagem múltipla ( polylinker ) -promotores fortes e genes repórter em caso de vetores de expressão VETORES OU PLASMIDEOS OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

22. GENES MARCADORES PARA SELEÇAO DOS TRANSFORMANTES Antibióticos Genes de proteínas fluorescentes como GFP ou Luciferase Genes de tolerância a elementos tóxico às células (ex. Mer) Marcadores metabólicos ou auxotróficos OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

23. -Sequência responsável pela auto-replicação (Ori) -Genes Marcadores para seleção -Sítio de clonagem múltipla ( polylinker ) -promotores fortes e genes repórter em caso de vetores de expressão VETORES OU PLASMIDEOS OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

24. MULTIPLE CLONING SITE - Polylinker ou MCS OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

25. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Obtenção de um OGM: Passo à passo - Amplificação Fragmento de Interesse (PCR) -Escolha de um Vetor de Transformação -Escolha do método de Transformação -Escolha do método de seleção dos OGM’s

26. METODOS DE TRANFORMAÇAO - HEAT SHOCK E possível induzir diversos tipos de células a um estado artificial de competência, esfriando rapidamente as células em presença de cátios divalentes como Ca 2+ (CaCl 2 ). Este tipo de tratamento químico deixa a membrana celular permeável à moléculas externas. Após a indução da competência, as células são incubadas com o DNA estrangeiro de interesse (geralmente plasmídeos) em gelo e em seguida é realizad um choque térmico de 42 o C (30-120”) Rendimento: ˜10 8 colônias/µg de DNA OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

27. OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -ELETROPORAÇAO Eletroporação ou eletropermeabilização é o aumento significativo na condutividade e permeabilidade da membrana plasmática causado pela aplicação de um campo elétrico externo Este método pode ser utilizado na transformação de bactérias, leveduras, protoplastos e células de mamíferos METODOS DE TRANFORMAÇAO

28. METODOS DE TRANFORMAÇAO -BIOBALISTICA ou GeneGun OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS Sistema de entrega de partículas, originalmente desenvolvido para transformação de plantas. O aparato “literalmente” injeta partículas (geralmente metais pesados) recobertas com preparações de DNA (plasmídeos) que contém o gene de interesse, diretamente no citoplasma das células-alvo Esse tipo de aparato permite a injeção de material genético em praticamente quanlquer tipo celular, incluíndo: bactérias, plantas, células de mamíferos, e até mesmo organelas e plastídeos

29. METODOS DE TRANFORMAÇAO -CONJUGAÇAO OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS Método conveniente de transferência de material genético para um variedade de alvos. A vantagem da conjugação é o dano mínimo à parede celular da célula-alvo, além da capacidade de transferência de grandes quantidades de material ( i.e cromossomos) Plasmídeos F: protótipo dos plasmídeos conjugativos. São plasmídeos epissomais (plasmídeos capazes de se integrar no cromossomo bacteriano por recombinação homóloga). Plasmídeos que carregam OriV e OriT e geralmente são cópia única.

30. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Obtenção de um OGM: Passo à passo - Amplificação Fragmento de Interesse (PCR) -Escolha de um Vetor de Transformação -Escolha do método de Transformação -Escolha do método de seleção dos OGM’s

31. SELEÇAO POR GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS -Seleção por genes que induzem resistência à antibióticos PROBLEMA:transferência dos genes de resistência para hospedeiro ou flora associada OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

32. SELECAO POR BIOLUMINESCENCIA OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

33. SELECAO AZUL/BRANCO – Operon Lac Metodologia baseada no operon Lac: Enzima b-galactosidade: formada pelas subunidades a e Ω codificadas por regiões específicas do operón – capaz de hidrolisar X-gal em 5-bromo-4-clorindol (coloração azul) Como funciona: Um vetor codificando a subunidade  da proteína Lac Z que possua um MCS interno; o cromossomo da bactéria hospedeira codifique a subunidade Ω que seja capaz de formar uma enzima  -galactosidade funcional: Se LacZ a sofrer inserção de um fragmento de DNA, a produção da  -galagtosidade é interrompida e as colônias ficam brancas (pois não hidrolisam mais o X-gal) *não é uma boa escolha como único marcador…..PORQUE? OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

34. SELECAO POR MARCADORES METABOLICOS: Linhagens auxotróficas OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

35. VETORES DE EXPRESSAO EM PROCARIOTOS OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -Algumas características a mais que um simples vetor de clonagem: -Promotor -Sequências regulatórias -RBS (ribosome biding site) -Sequência terminal -Gene repórter (opcional)

36. ESTABILIDADE PLASMIDIAL -A estabilidade dos vetores plasmidiais é influenciada por diversos fatores como: natureza da células-hospedeira, natureza do plasmídeo e condições ambientais -A manutenção do plasmídeos naturais é garantida pela expressão de diversos genes, e um sistema bastante estudado é o de toxina-antitoxina que atualmente é disponibilizado em kits comerciais; SISTEMA TOXINA/ANTITOXINA OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -A utilização de seleção por marcador metabólico também garante estabilidade

37. ESTABILIDADE PLASMIDIAL OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS RNA DE INTERFERENCIA

38. OUTROS METODOS DE OBTENÇAO DE OGMs -TRANSDUÇAO VIRAL OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -Envolve a introdução do DNA exógeno dentro da célula bacteriana por um fago espécie-específico. -Um vez injetado no citoplasma, o DNA se integra no genoma bacteriano da mesma maneir que no método de transformação bacteriana (recombinação) -Como na transformação convencional, fragmentos lineares de DNA que não se integram acabam sendo degradados pelas enzimas nucleases

39. OUTROS METODOS DE OBTENÇAO DE OGMs -TRANSDUÇAO VIRAL OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -Envolve a introdução do DNA exógeno dentro da célula bacteriana por um fago espécie-específico. -Um vez injetado no citoplasma, o DNA se integra no genoma bacteriano da mesma maneir que no método de transformação bacteriana (recombinação) -Como na transformação convencional, fragmentos lineares de DNA que não se integram acabam sendo degradados pelas enzimas nucleases

40. -Transdução Viral: clonando fragmentos de interesse OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

41. OUTROS METODOS DE OBTENÇAO DE OGMs -Transposons OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS -Elementos transponíveis, “ jumping genes ”: capazes de se mover de um lugar ao outro dentre de um genoma ou entre genomas; requer sequências-alvo de DNA; transposase -causam mutações, silenciam genes, regulam expressão gênica e podem inserir genes ou fragmento de DNA exógenos em locais pré-determinados

42. -Transposons: Tn3 e Tn5 trasnposons selvagens que carregam genes de resistência à antibióticos OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

43. -Transposons: kits comerciais OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

44. OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

45. BIOBRICKS OBTENCAO DE OGMs - PROCARIOTOS

46. OBTENCAO DE OGMs - LEVEDURAS ENGENHARIA GENETICA DE LEVEDURAS VETORES: clonagem e expressão YEAST ARTIFICIAL CROMOSOME (YAC) : vetor utilizado na clonagem de grandes fragmentos de DNA (100 a 3000 Kb). São cromossomos artificial, possuem telômero, centrômero, Ori e são preservado em células de leveduras (lineriazação) - YEp e YIp - Vantagem: leveduras são capazes de fazer modificações pós-tanscricionais como glicosilações, metilações, acetilações, ETC! - S. cerevisae : microrganismo eucarioto modelo; permite a análise de produtos gênicos de outros organismos eucarioto

47. OBTENCAO DE OGMs BIG PICTURE!

48. ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS ENGENHARIA GENETICA DE MICRORGANISMOS Aplicações dos OGMs & Indústria

49. APLICAÇOES DOS OGMs Biosensores Combinam um componente biológico com um componente fisicoquimico de detecão: -tecidos, enzimas, anticorpos, receptores, organelas, microrganismos, geralmente gerados por engenharia genética -transdutor ou elemento detector Exs: Monitoramento de glicose em pacientes diabéticos (glicose oxidase), microrganismos para monitoramento ambiental, detecção de metabólitos tóxicos, etc…

50. APLICAÇOES DOS OGMs Bioremediação Processo que utiliza microrganismos, fungos, plantas ou suas enzimas para devolver ao seu estado natural ambientes contaminados ou modificados devido ação humana. A utilização de OGMs na bioremediação traz a oportuidade de importar vias metabólicas existentes em organismos não relatos com o ambiente a ser bioremediado Exs: biodegradação de metais pesados, lixo radioativo ( Deinococcus radiodurans ), compostos químicos, etc…..

51. APLICAÇOES DOS OGMs Vacinas Recombinantes: Bactérias ou Vírus “engenheirados” contendo material genéticos inócuo capaz de gerar resposta imunológica em resposta a determinado patógeno.

52. APLICAÇOES DOS OGMs Microrganismos como fábricas do futuro??? -Utilização de OGMs na produção de moléculas de interesse econômico: moléculas farmacológicas, insulina, bioetanol, hidrogênio, biopolímeros Relocation mechanism Assembly line Central computer Security fence Outer and internal walls

53. APLICAÇOES DOS OGMs Produtos biotecnológicos já comercializados: -Insulina -Interferons -Interleucinas -Albumina -Fator VIII -Vacinas recombintes -Produtos alimentícios -Produtos biotecnológicos de aplicação industrial

55. APLICAÇOES DOS OGMs Biocombustíveis

56. APLICAÇOES DOS OGMs Biolixiviação -Extração de metais específicos através do uso de bactérias naturais desses nichos ecológicos. A biolixiviação atualmente é utilizada na extração de cobre, zinco, chumbo, arsênico, níquel, ouro, molibdênio e colbalto -A transferência de material genético para bactérias envolvidas no processo de biolixiviação tem-se demonstrado um desafio biotecnológico, principalmente devido aos habitast extremos os quais essas bactérias vivem

57. APLICAÇOES DOS OGMs

58. Assuntos para refletir……. -Porém……..existem obstáculos a serem superados com a aplicação da tecnologia do DNA recombinante -Experimentos que envolvem questões éticas: testes genéticos, triagem de doenças que não existem cura, doenças autossômicas…. -Consumo de plantas/animais trangênicos….ainda não existem estudos a longo prazo….. -Microrganismos geneticamente moficados: um vez expostos no meio ambiente, seja no uso como vacinas, bioremediação, e outros, ainda não existem estudos dos possíveis impactos ambientais…. QUESTOES ETICAS

59. BREAKTHROUGH