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Aplicación de sistemas de secuenciación
masiva (NGS) en el Screening Genético
Preimplantacional (DGP-a)
Laboratorio de
GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
TECNALIA
Bilbao,15 Diciembre 2016
2 ▌ 2 ▌
Indíce
1. LABORATORIO
GENÉTICA
2. ANEUPLOIDÍAS
CROMOSÓMICAS Y PGS
3. SISTEMAS DE
ANÁLISIS
4. SECUENCIACIÓN
MASIVA (NGS)
Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la
genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad
tecnológica:
Secuenciación Masiva
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PCR a Tiempo Real
Cultivo celular
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
El Laboratorio de Genética estructura su actividad en torno a cuatro pilares
fundamentales fuertemente conectados entre si:
PROYECTOS I+D DIAGNÓSTICO GENÉTICO
ONCOLOGICO*
GENÉTICA PREIMPLANTACIONAL*
ANALISIS DEL MICROBIOMA
(METAGENOMICA)
* TECNALIA es el Primer centro
Autorizado por el Departamento de
Salud del Gobierno Vasco
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
DIAGNÓSTICO GENÉTICO ONCOLÓGICO
Diagnóstico de Síndromes Tumorales Hereditarios
Síndrome de Mama y Ovario Hereditario (CMOH): BRCA1, BRCA2, CHEK2, ATM,
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específicos, de las poblaciones microbianas
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• Composición microbiana de diferentes
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Indíce
1. LABORATORIO
GENÉTICA
2. ANEUPLOIDÍAS
CROMOSÓMICAS Y PGS
3. SISTEMAS DE
ANÁLISIS
4. SECUENCIACIÓN
MASIVA (NGS)
ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS
Cambio en el número de cromosomas característico de la especie.
22 parejas + cromosomas sexuales. 46 cromosomas
ANEUPLOIDÍA EMBRIONARIA
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Alteraciones
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Las aneuploidías constituyen la causa mas importante de aborto espontáneo o fallo
de implantación.
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> 50% de los embriones IVF aneuploides durante las primeras divisiones (estadío cleavage)
Las aneuploidías están fuertemente asociadas a la edad materna: aumento % de
embriones aneuploides en madres de edad avanzada
%EmbrionesAneuploides
Edad Materna (Años)
(Franasiak, JM, et al)
(Wells, D. et al)
Edad Materna (Años)
Tasadeimplantación
X X
X
Euploide/Aneuploide
X SETo
SET
???
?
Probabilidad(%)embrionesNO-EUPLOIDES/cohorte
Edad Materna (Años)
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ANEUPLOIDÍAS EMBRIONARIAS vs EDAD MATERNA
SCREENING GENETICO PREIMPLANTACIONAL (PGS/DGP-a)
Técnica de diagnóstico prenatal que se realiza en embriones generados durante un proceso de
Fecundación In Vitro (FIV) y tiene como finalidad la identificación de alteraciones en el número de
cromosomas del embrión.
TasaImplantación(%)
TasaAborto(%)
Harton et al, Fertil Steril 2013
PGS NO-PGS
PGS NO-PGS
% Implantación (No PGS vs PGS)
Yang Z; Mol Cytogenet. 2012 aCGH 46% vs 69%
Yang Z; Mol Cytogenet. 2013 aCGH 33% vs 65%
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Indíce
1. LABORATORIO
GENÉTICA
2. ANEUPLOIDÍAS
CROMOSÓMICAS Y PGS
3. SISTEMAS DE
ANÁLISIS
4. SECUENCIACIÓN
MASIVA (NGS)
Analizar Aneuploidías cromosómicas
Análisis de un grupo de cromosomas (no 24)
Excesiva manipulación de la muestra (blastómero)
Laboriosa
Solapamiento de Fluoróforos
FISH
ΔΔCt
Análisis simultáneo de 24 cromosomas
Método Rápido. No requiera WGA
4 Marcadores/cromosoma
Pocas muestras/ensayo
Requiere más de una célula de partida
qPCR
MICROARRAYS ADN
aCGH
SNP arrays
Análisis simultáneo de 24 cromosomas
Múltiples Marcadores/cromosoma
Tiempo analisis ≈24h
No poliploidías
Solo 1 muestra/ensayo
Análisis simultáneo de 24 cromosomas
Detección de triploidías, DUP, traslocaciones
Requiere analizar padres
Tiempo de análisis largo
Indíce
1. LABORATORIO
GENÉTICA
2. ANEUPLOIDÍAS
CROMOSÓMICAS Y PGS
3. SISTEMAS DE
ANÁLISIS
4. SECUENCIACIÓN
MASIVA (NGS)
Amplificación Genoma
PCR-Based
Amplificación Lineal
Mixtos (Sureplex)
+
Secuenciación
ACGGTAGCTAGCTAA
Miles de secuencias o “reads” a lo largo de diferentes regiones del genoma
Fragmentación Adaptadores
SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
ACGGTAGCTAGCTAA
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Recuento de Lecturas
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Nº de Lecturas
SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
El recuento del número de lecturas en cada cromosoma
es un indicador del numero de copias del cromosoma
NumerodelecturasNormalizado
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NumerodelecturasNormalizado
SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
47 XX, +18
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I Jornada Actualización en Genética Reproductiva y Fertilidad
VENTAJAS NGS
MULTIPLEXADO DE MUESTRAS (REDUCCIÓN DE COSTE/ANALISIS)
Amplificación
Genoma
+
Fragmentación Adaptadores
Muestra1Muestra2
Amplificación
Genoma
+
Adaptadores
CGTA
TACC
Embrión 1
Embrión 2 TACC
TACC
TACC
CGTA
CGTA
CGTA
VeriSeq Illumina posibilidad de analizar hasta 24 embriones simultáneamente
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MOSAICISMO
Msaico 46/45n
Secuenciación Masiva mayor rango
dinámico y sensibilidad que otras
tecnologías
Identificación de alteraciones 20%
células biopsiadas: Mosaicismo
Significado clínico del mosaicismo???. Transferencia vs No transferencia????
Embriones mosaicos tienen menor probabilidad de implantación.
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MOSAICISMO
No obstante, la implantación del embrión y embarazo es posible.
La transferencia de estos embriones puede ser considerada en determinadas situaciones
Fert and Steteril, 2016
Scott RT, et al., Fert and Steteril, 2016 Wells D, et al., Fert and Steteril, 2016
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: TRASLOCACIONES
NGS detección de ganancias o pérdidas de material genético (aneuploidías)
Poco eficientes en la identificación de alteraciones que NO asociadas a cambios en el
contenido de ADN: TRANSLOCACIONES BALANCEADAS
No obstante, individuos portadores de Translocaciones Balanceadas alta probabilidad
de formar gametos “desequilibrados”
Individuos fenotípicamente normales, pero:
• Infértiles: Altas tasas de aborto espontáneo/fallos de implantación
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retraso mental
Aneuploidía
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Embrión
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: TRASLOCACIONES
El objetivo de PGS en estos casos:
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normal/equilibrado
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IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: ANEUPLOIDÍAS SEGMENTALES
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cromosómico
Origen:
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Translocaciones Balanceadas/No Balanceadas
Secuenciación masiva aumento de la resolución de análisis: 6-14 Mb
Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la
genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad
tecnológica:
Secuenciación Masiva
Secuenciación Capilar
DNA Microarray
PCR a Tiempo Real
Cultivo celular
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la
genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad
tecnológica:
Secuenciación Masiva
Secuenciación Capilar
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PCR a Tiempo Real
Cultivo celular
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MUTACIONES PUNTUALES
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: DNA MITOCONDRIAL???
30-40% embriones Euploides: NO IMPLANTAN
OTRAS CAUSAS: DNA Mitocondrial??
DNA Mitocondrial elevado:
embriones Aneuploides
embriones derivados de mujeres de avanzada edad
30% embriones euploides no implantan
NGS
cuantificación de
DNA
mitocondrial
CONCLUSIONES: por qué en Tecnalia empleamos NGS
Reducción de costes: Multiplexado de muestras o análisis de múltiples muestras /
ensayo, menor coste/embrión
Tiempo de análisis corto: Compatible con transferencias en fresco
Detección de Mosaicismos: Cuantificación directa del número de lecturas/cromosomas
mayor rango dinámico: Mayor sensibilidad
Detección de Aneuploidías parciales de cromosomas: Mayor Resolución NGS permite la
detección de guanacias/pérdidas parciales de cromosomas: Aneuploidías Segmentales
NGS permite análisis combinados: PGS + monogénicas (mutaciones puntuales)
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Visita nuestro blog:
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I Jornada Actualización en Genética Reproductiva y Fertilidad

  • 1. Aplicación de sistemas de secuenciación masiva (NGS) en el Screening Genético Preimplantacional (DGP-a) Laboratorio de GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR TECNALIA Bilbao,15 Diciembre 2016
  • 2. 2 ▌ 2 ▌ Indíce 1. LABORATORIO GENÉTICA 2. ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS Y PGS 3. SISTEMAS DE ANÁLISIS 4. SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS)
  • 3. Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad tecnológica: Secuenciación Masiva Secuenciación Capilar DNA Microarray PCR a Tiempo Real Cultivo celular LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
  • 4. El Laboratorio de Genética estructura su actividad en torno a cuatro pilares fundamentales fuertemente conectados entre si: PROYECTOS I+D DIAGNÓSTICO GENÉTICO ONCOLOGICO* GENÉTICA PREIMPLANTACIONAL* ANALISIS DEL MICROBIOMA (METAGENOMICA) * TECNALIA es el Primer centro Autorizado por el Departamento de Salud del Gobierno Vasco LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
  • 5. DIAGNÓSTICO GENÉTICO ONCOLÓGICO Diagnóstico de Síndromes Tumorales Hereditarios Síndrome de Mama y Ovario Hereditario (CMOH): BRCA1, BRCA2, CHEK2, ATM, RAD51C, BRIP, PALB2, BARD1, PTEN, TP53, STK11, FANCD, CDH1, NBN, NF1 y MUTYH Síndrome de Cáncer Colorectal Hereditario (CCH): MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1, EPCAM, APC, MUTYH, TP53, PTEN, STK11, SMAD4, CDH1 y BMPR1A Cáncer de Páncreas Hereditario, Melanoma maligno familiar, Carcinoma Medular de Tiroides… Diagnóstico de enfermedades Neoplásicas (tumores somáticos) Selección del tratamiento apropiado. Aumentar la eficacia del tratamiento farmacológico. Disminuir los efectos adversos. Clasificación / Estratificación de Pacientes en Ensayos Clínicos (EECC). Identificación de biomarcadores predictivos (“Companion Diagnostics”).
  • 6. PROYECTOS I+D Tecnalia desarrolla distintos proyectos I+D en ámbito de la identificación de biomarcadores de diagnóstico y desarrollo de nuevos sistemas de análisis: ONCOLOGÍA Utilización de nuevos marcadores moleculares de diagnóstico (PROSDIAG) Plataforma de análisis predictivo de respuesta a tratamientos (ONKOCHANCE) Biomarcadores pronóstico en cáncer colorrectal Nuevos biomarcadores diagnóstico en cáncer de pulmón. Plataforma para la Caracterización del Paciente Oncológico (HEDAI) GENÉTICA REPRODUCTIVA Nuevas estrategias de análisis de Aneuploidías cromosómicas Implementación de la tecnología NGS (Next Generation Sequencing) para la identificación de mutaciones (DGP) y alteraciones cromosómicas (PGS) en embriones.
  • 7. ANÁLISIS DEL MICROBIOMA (METAGENÓMICA) Análisis e identificación, mediante la secuenciación de fragmentos génicos específicos, de las poblaciones microbianas presentes en diferentes muestras ambientales. • Composición microbiana de diferentes suelos en áreas de cultivo • Análisis del microbioma bucal y el efecto de diferentes nanocomponentes de implantes dentales • Estudio del microbioma intestinal asociado al desarrollo de alimentos probióticos
  • 8. Indíce 1. LABORATORIO GENÉTICA 2. ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS Y PGS 3. SISTEMAS DE ANÁLISIS 4. SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS)
  • 9. ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS Cambio en el número de cromosomas característico de la especie. 22 parejas + cromosomas sexuales. 46 cromosomas ANEUPLOIDÍA EMBRIONARIA ERROR MEIOSIS Alteraciones segregación de cromosomas ERROR MITOSIS Alteraciones segregación de cromosomas durante primeras divisiones embrión Gametos Aneuploides
  • 10. ANEUPLOIDÍAS EMBRIONARIAS Las aneuploidías constituyen la causa mas importante de aborto espontáneo o fallo de implantación. 70% abortos espontáneos 1er trimestre: anomalías cromosómicas (Kung A. Reprod Biomed. 2015) 90% embriones aneuploides abortan (Munne S. Fertil Steril 2005)
  • 11. Aneuploidías embrionarias altamente frecuentes en la especie humana ANEUPLOIDÍAS EMBRIONARIAS vs EDAD MATERNA > 50% de los embriones IVF aneuploides durante las primeras divisiones (estadío cleavage) Las aneuploidías están fuertemente asociadas a la edad materna: aumento % de embriones aneuploides en madres de edad avanzada %EmbrionesAneuploides Edad Materna (Años) (Franasiak, JM, et al) (Wells, D. et al) Edad Materna (Años) Tasadeimplantación
  • 12. X X X Euploide/Aneuploide X SETo SET ??? ? Probabilidad(%)embrionesNO-EUPLOIDES/cohorte Edad Materna (Años) (Franasiak, JM, et al) ANEUPLOIDÍAS EMBRIONARIAS vs EDAD MATERNA
  • 13. SCREENING GENETICO PREIMPLANTACIONAL (PGS/DGP-a) Técnica de diagnóstico prenatal que se realiza en embriones generados durante un proceso de Fecundación In Vitro (FIV) y tiene como finalidad la identificación de alteraciones en el número de cromosomas del embrión. TasaImplantación(%) TasaAborto(%) Harton et al, Fertil Steril 2013 PGS NO-PGS PGS NO-PGS % Implantación (No PGS vs PGS) Yang Z; Mol Cytogenet. 2012 aCGH 46% vs 69% Yang Z; Mol Cytogenet. 2013 aCGH 33% vs 65% Scott RT; Fertil Steril qPCR 47,9% vs 66,4%
  • 14. Indíce 1. LABORATORIO GENÉTICA 2. ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS Y PGS 3. SISTEMAS DE ANÁLISIS 4. SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS)
  • 15. Analizar Aneuploidías cromosómicas Análisis de un grupo de cromosomas (no 24) Excesiva manipulación de la muestra (blastómero) Laboriosa Solapamiento de Fluoróforos FISH
  • 16. ΔΔCt Análisis simultáneo de 24 cromosomas Método Rápido. No requiera WGA 4 Marcadores/cromosoma Pocas muestras/ensayo Requiere más de una célula de partida qPCR
  • 17. MICROARRAYS ADN aCGH SNP arrays Análisis simultáneo de 24 cromosomas Múltiples Marcadores/cromosoma Tiempo analisis ≈24h No poliploidías Solo 1 muestra/ensayo Análisis simultáneo de 24 cromosomas Detección de triploidías, DUP, traslocaciones Requiere analizar padres Tiempo de análisis largo
  • 18. Indíce 1. LABORATORIO GENÉTICA 2. ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS Y PGS 3. SISTEMAS DE ANÁLISIS 4. SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS)
  • 19. Amplificación Genoma PCR-Based Amplificación Lineal Mixtos (Sureplex) + Secuenciación ACGGTAGCTAGCTAA Miles de secuencias o “reads” a lo largo de diferentes regiones del genoma Fragmentación Adaptadores SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
  • 20. ACGGTAGCTAGCTAA Alineamiento de las secuencias a un genoma de referencia Únicamente se secuencia una pequeña parte del genoma (aprox 0,1X) Los fragmentos secuenciados se alinean con su correspondiente secuencia en cada uno de los 24 cromosomas SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS 35-150 bp
  • 21. Cromosomas ….. Recuento de Lecturas 1 32 214 Nº de Lecturas SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
  • 22. SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS El recuento del número de lecturas en cada cromosoma es un indicador del numero de copias del cromosoma NumerodelecturasNormalizado Euploide Muestra NumerodelecturasNormalizado
  • 27. MULTIPLEXADO DE MUESTRAS (REDUCCIÓN DE COSTE/ANALISIS) Amplificación Genoma + Fragmentación Adaptadores Muestra1Muestra2 Amplificación Genoma + Adaptadores CGTA TACC Embrión 1 Embrión 2 TACC TACC TACC CGTA CGTA CGTA VeriSeq Illumina posibilidad de analizar hasta 24 embriones simultáneamente
  • 28. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MOSAICISMO Msaico 46/45n Secuenciación Masiva mayor rango dinámico y sensibilidad que otras tecnologías Identificación de alteraciones 20% células biopsiadas: Mosaicismo
  • 29. Significado clínico del mosaicismo???. Transferencia vs No transferencia???? Embriones mosaicos tienen menor probabilidad de implantación. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MOSAICISMO No obstante, la implantación del embrión y embarazo es posible. La transferencia de estos embriones puede ser considerada en determinadas situaciones Fert and Steteril, 2016 Scott RT, et al., Fert and Steteril, 2016 Wells D, et al., Fert and Steteril, 2016
  • 30. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: TRASLOCACIONES NGS detección de ganancias o pérdidas de material genético (aneuploidías) Poco eficientes en la identificación de alteraciones que NO asociadas a cambios en el contenido de ADN: TRANSLOCACIONES BALANCEADAS No obstante, individuos portadores de Translocaciones Balanceadas alta probabilidad de formar gametos “desequilibrados” Individuos fenotípicamente normales, pero: • Infértiles: Altas tasas de aborto espontáneo/fallos de implantación • Altas probabilidades de nacimientos con anomalías congénitas o retraso mental Aneuploidía Cromosómica Embrión
  • 31. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: TRASLOCACIONES El objetivo de PGS en estos casos: Identificación de embriones con complemento de cromosomas normal/equilibrado Disminuir el riesgo de anomalías congénitas Incrementar las tasas de embarazo y nacimientos en parejas infértiles
  • 32. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: ANEUPLOIDÍAS SEGMENTALES Alteraciones que conllevan la pérdida o ganancia de un pequeño fragmento cromosómico Origen: Fallos en la meiosis durante formación de gametos Primeras divisiones mitóticas del embrión Translocaciones Balanceadas/No Balanceadas Secuenciación masiva aumento de la resolución de análisis: 6-14 Mb
  • 33. Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad tecnológica: Secuenciación Masiva Secuenciación Capilar DNA Microarray PCR a Tiempo Real Cultivo celular LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
  • 34. Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad tecnológica: Secuenciación Masiva Secuenciación Capilar DNA Microarray PCR a Tiempo Real Cultivo celular LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
  • 35. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MUTACIONES PUNTUALES
  • 36. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: DNA MITOCONDRIAL??? 30-40% embriones Euploides: NO IMPLANTAN OTRAS CAUSAS: DNA Mitocondrial?? DNA Mitocondrial elevado: embriones Aneuploides embriones derivados de mujeres de avanzada edad 30% embriones euploides no implantan NGS cuantificación de DNA mitocondrial
  • 37. CONCLUSIONES: por qué en Tecnalia empleamos NGS Reducción de costes: Multiplexado de muestras o análisis de múltiples muestras / ensayo, menor coste/embrión Tiempo de análisis corto: Compatible con transferencias en fresco Detección de Mosaicismos: Cuantificación directa del número de lecturas/cromosomas mayor rango dinámico: Mayor sensibilidad Detección de Aneuploidías parciales de cromosomas: Mayor Resolución NGS permite la detección de guanacias/pérdidas parciales de cromosomas: Aneuploidías Segmentales NGS permite análisis combinados: PGS + monogénicas (mutaciones puntuales) Detección y análisis de ADN mitocondrial (¿?)